Os cientistas têm grandes esperanças na tecnologia CRISPR / Cas9, que permite mudanças de alta precisão nos genomas de organismos vivos, incluindo humanos. Todos os novos artigos científicos são publicados descrevendo vários tipos de sistemas CRISPR, bem como suas modificações. "Lenta.ru" fala sobre as descobertas nesta área, feitas em 2016.
Milhares deles
CRISPR / Cas9 é um sistema de imunidade adaptativa bacteriana que permite aos microrganismos combater os vírus. É composto por espaçadores - seções de DNA correspondentes a certos fragmentos (protoespaciais) do DNA do agente infeccioso. Os espaçadores codificam moléculas específicas de crRNA que se ligam à enzima Cas9. O complexo resultante se liga à cadeia de DNA do vírus e o Cas9 funciona como uma tesoura, cortando-o.
Na verdade, CRISPR / Cas9 é apenas um dos muitos sistemas semelhantes que as bactérias e arqueas possuem. Os cientistas os dividem em duas classes. A primeira classe inclui os sistemas CRISPR dos tipos I, III e IV, e a segunda - II e V. O tipo II contém a proteína Cas9 envolvida na aquisição de novos espaçadores, no acúmulo de crRNA na célula e na clivagem do DNA. Em outros sistemas, complexos de multiproteínas são usados para esses fins. Isso torna o tipo II o tipo mais simples de sistema CRISPR adequado para as necessidades de engenharia genética.
Os tipos podem, por sua vez, ser subdivididos em subtipos, dependendo de quais genes adicionais estão associados ao CRISPR. Por exemplo, os sistemas IIA contêm o gene csn2, que codifica uma proteína que se liga ao DNA e está envolvida na aquisição de espaçadores. Nos sistemas IIB, csn2 está ausente, mas há um gene cas4, cuja função ainda é desconhecida, e os sistemas IIC não têm csn2 nem cas4.
Tesouros dentro das bactérias
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Todos os sistemas CRISPR conhecidos foram descobertos por cientistas em bactérias cultivadas em condições de laboratório. No entanto, existe um grande número de microrganismos não cultivados, que incluem arqueas e bactérias. Eles geralmente vivem em condições extremas - fontes minerais ou corpos d'água tóxicos em minas abandonadas. No entanto, os pesquisadores podem isolar o DNA deles e identificar regiões específicas nele. Em um novo artigo publicado na Nature em 22 de dezembro, geneticistas da Universidade da Califórnia, Berkeley decodificaram genomas de comunidades microbianas naturais, descobrindo outras variações do sistema CRISPR.
Bacteriófago - um vírus que infecta bactérias
Imagem: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Os cientistas conseguiram descobrir que alguns tipos de nanoorganismos semelhantes a arche, pouco estudados, ARMAN, também possuem CRISPR / Cas9, embora se acreditasse que apenas bactérias os tinham. Observa-se que esse sistema ocupa um lugar intermediário entre os subtipos IIC e IIB e pode servir como defesa contra genes "saltadores" do parasita (transposons) que entram no microrganismo vindos de outras arquéias. Uma tentativa de reproduzir a atividade da arquea CRISPR / Cas9 em E. coli (Escherichia coli) não deu em nada, o que indica a existência de alguns mecanismos específicos adicionais regulando o sistema.
Novos tipos de sistemas dentro da segunda classe, CRISPR / CasX e CRISPR / CasY, também foram identificados a partir de bactérias que vivem em águas subterrâneas e sedimentos. O sistema CRISPR / CasX inclui proteínas Cas1, Cas2, Cas4 e CasX. Este último, conforme demonstrado por experimentos com E. coli, se distingue pela atividade de nuclease, ou seja, é capaz de clivar DNA estranho como Cas9. No entanto, isso acontece apenas se a sequência TTCN estiver na frente dos protoespaçadores, onde N é qualquer um dos quatro nucleotídeos. Tais sequências são chamadas de PAM (protoespaçador adjacente motif - motivo adjacente ao protoespaçador). O sistema CRISPR / Cas9 também possui seu próprio PAM - NGG, que deve estar localizado após o protoespaçador. Além disso, o CRISPR / CasY é capaz de cortar o DNA se houver uma sequência TA PAM próxima ao local alvo.
Qual é a promessa desta descoberta? O fato é que os sistemas detectados são os mais compactos conhecidos até o momento. Segundo os cientistas, a pequena quantidade de proteínas necessária para o seu trabalho torna o CRISPR / CasX e o CRISPR / CasY ferramentas convenientes para a edição de DNA. Além disso, estudos metagenômicos, nos quais se estuda o DNA obtido do ambiente, vão revelar outros tipos de sistemas CRISPR úteis para a engenharia genética.
O caminho para a excelência
Claro, existe uma alternativa para a busca de sistemas CRISPR na natureza - o aprimoramento da tecnologia CRISPR / Cas9 já existente. Apesar de sua alta precisão, ela comete erros ao cortar o DNA no lugar errado. Isso torna difícil fazer as mudanças corretas nos genes e, portanto, tratar doenças hereditárias com eficácia. Portanto, os cientistas estão procurando maneiras de melhorar o desempenho do sistema. Em 2016, houve muitos artigos científicos dedicados a modificar o CRISPR e transformá-lo em várias ferramentas genéticas.
Proteína Cas9 e crRNA - os principais componentes do sistema CRISPR
Imagem: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Assim, em 8 de dezembro, a revista Cell publicou um artigo de cientistas da Universidade de Toronto, que criaram o "anti-CRISPR" - um sistema que desliga o mecanismo sob certas condições. Isso torna possível suprimir a atividade do Cas9 se o RNA guia se ligar ao fragmento errado e evitar erros. O anti-CRISPR é composto por três proteínas inibidoras de nuclease. Naturalmente, inicialmente não foi inventado por cientistas, mas por vírus, que assim neutralizaram a imunidade das bactérias.
Em junho, pesquisadores americanos, juntamente com colegas da Rússia, confirmaram que o sistema CRISPR / C2c2, obtido do fusobacterium Leptotrichia shahii, é capaz de cortar RNA de fita simples. Como resultado, o sistema CRISPR pode ser usado para nocautear - suprimir funções - do RNA mensageiro, que carrega informações dos genes para os ribossomos, onde as proteínas são sintetizadas em sua base.
Em maio, pesquisadores da Universidade da Califórnia criaram o CRISPR-EZ, uma tecnologia que permite que novas moléculas de DNA sejam inseridas nos genomas de embriões de camundongos com quase 100% de sucesso. O sistema CRISPR / Cas9 é injetado em óvulos fertilizados de animais usando uma agulha microscópica e uma pequena descarga elétrica. Em seu experimento, os cientistas conseguiram introduzir uma mutação em um gene em 88% dos ratos. Isso excede o número de camundongos geneticamente modificados produzidos pela edição CRISPR, que usa injeções convencionais.
Em abril, usando uma variante mutante de Cas9 que carece de atividade de nuclease, biólogos moleculares da Escola de Medicina da Universidade de Massachusetts desenvolveram a tecnologia CRISPRainbow. O RNA guia, que indica onde as enzimas se fixam, continha marcadores fluorescentes, que permitem, por exemplo, rastrear o movimento de elementos genéticos móveis.
O mosquito Anopheles pode ser a primeira vítima dos sistemas CRISPR
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Admirável mundo novo
Os cientistas já estão usando sistemas CRISPR para criar organismos geneticamente modificados, como o mosquito da malária, que espalham genes nocivos entre seus parentes selvagens. Este método é denominado gene drive. Se um dos pais de um indivíduo era portador de um gene mutante, ele o passaria para sua prole com 50 por cento de probabilidade. Isso ocorre porque o pai tem duas cópias do gene e apenas uma delas está com defeito. O CRISPR é capaz de copiar um fragmento mutante e inseri-lo em um gene saudável. Como resultado, a prole obtém a mutação com 100% de probabilidade.
Em 2016, especialistas do Comitê Consultivo de DNA Recombinante (RAC) aprovaram um pedido da Universidade da Pensilvânia para realizar testes de modificação genética humana usando a tecnologia CRISPR / Cas9.
No entanto, eles foram ultrapassados pelos chineses. Em novembro, a revista Nature relatou que cientistas chineses pela primeira vez introduziram células com genes modificados pelo sistema CRISPR / Cas9 em humanos. Os pesquisadores extraíram células imunológicas (linfócitos T) do sangue de um paciente com câncer de pulmão metastático e, em seguida, usaram a tecnologia CRISPR para desligar o gene que codifica a proteína PD-1. Este último demonstrou suprimir a imunidade ao promover o crescimento do tumor. Os cientistas cultivaram as células editadas, aumentando seu número e injetando-as de volta no corpo humano. Resta saber se a terapia genética vai lidar com a doença.
Os sistemas CRISPR também podem ser usados para combater o HIV e doenças hereditárias humanas. No entanto, mais pesquisas são necessárias para desenvolver tratamentos eficazes. É claro que não estamos falando de mutantes, como nos filmes de ficção científica, mas os cientistas poderão criar rapidamente organismos geneticamente modificados, por exemplo, plantas agrícolas com resistência a parasitas. Resta saber por que os cientistas que descobriram o CRISPR e descobriram como ele poderia ser usado ainda não receberam o Prêmio Nobel.
Alexander Enikeev
