Uma equipe internacional de cientistas dos Estados Unidos, França e China criou uma forma de vida semissintética. Embora já tenham sido feitas tentativas para obter bactérias com DNA modificado, os microrganismos se multiplicaram mal, exigiram condições especiais de crescimento e, por fim, se livraram das modificações introduzidas neles. "Lenta.ru" fala sobre um novo trabalho em que os pesquisadores conseguiram resolver esses problemas, tendo obtido uma criatura que é radicalmente diferente de toda a vida natural na Terra.
Mais recentemente, o DNA de todos os organismos vivos em nosso planeta consistia em quatro tipos de nucleotídeos contendo adenina (A), ou timina (T), ou guanina (G), ou citosina ©. Cordas de dezenas ou centenas de milhões de nucleotídeos formam cromossomos separados. Os genes encontrados nos cromossomos são sequências de nucleotídeos essencialmente longas, nas quais as sequências de aminoácidos das proteínas são codificadas. A combinação de três nucleotídeos consecutivos (códon ou tripleto) corresponde a um dos 20 aminoácidos. Assim, a vida usa um código genético de três letras (ATG, CGC e assim por diante) com base em um alfabeto de quatro letras (A, C, T, G).
Quando uma célula de um organismo precisa de uma proteína (polipeptídeo), o gene que a codifica é ativado. Este último está ligado a uma enzima especial chamada RNA polimerase, que, durante o processo de transcrição, começa a seguir a sequência de nucleotídeos e a criar uma cópia dela na forma de uma molécula chamada RNA mensageiro (mRNA). O RNA é muito semelhante ao DNA, mas em vez de timina, ele contém uracila (U). Em seguida, o mRNA sai do núcleo da célula e é direcionado aos ribossomos, onde, durante o processo de tradução, serve como receita para a criação da cadeia de aminoácidos da proteína.
Os pesquisadores decidiram mudar o código genético da Escherichia coli adicionando duas "letras" adicionais a ele. O fato é que o DNA nos organismos vivos é duplo, ou seja, é formado por duas cadeias que são emparelhadas por ligações complementares. Essas ligações são formadas entre a base do nucleotídeo A de uma cadeia e a base do nucleotídeo T da outra (da mesma forma, entre C e G). É por isso que os dois novos nucleotídeos sintéticos também devem ser capazes de se emparelhar complementarmente. A escolha recaiu sobre dNaM e d5SICS.
Escherichia coli E. coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Um par de nucleotídeos sintéticos foi inserido em um plasmídeo - uma molécula de DNA circular de fita dupla capaz de se multiplicar separadamente do resto do genoma bacteriano. Eles substituíram um par de nucleotídeos complementares A e T, que faziam parte do operon da lactose - um conjunto de genes que metabolizam o açúcar da lactose e as sequências de DNA não codificantes associadas a eles. Os nucleotídeos sintéticos não foram incluídos na região que a polimerase copia no mRNA.
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Por que os cientistas decidiram não inserir nucleotídeos sintéticos diretamente no gene, mas ao lado dele? O fato é que é muito difícil alterar um gene dessa forma para que ele permaneça funcional. Afinal, para isso você precisa ligar os novos códons resultantes a qualquer aminoácido. Para isso, por sua vez, é necessário ensinar a célula a produzir vários tipos de RNA de transporte (tRNA), que possam reconhecer esses códons.
As moléculas de tRNA desempenham a seguinte função. Eles, como caminhões, carregam um determinado aminoácido em uma extremidade, se aproximam do mRNA nos ribossomos e, por sua vez, começam a combinar o tripleto de nucleotídeos na outra extremidade com o códon. Se eles forem iguais, o aminoácido é removido e incorporado à proteína. No entanto, se não houver um tRNA adequado, a proteína não será sintetizada, o que pode afetar negativamente a viabilidade celular. Portanto, ao introduzir nucleotídeos sintéticos nos genes, os cientistas teriam que criar genes que codificam novos tRNAs que podem reconhecer códons artificiais e anexar o aminoácido correto ao polipeptídeo. No entanto, a tarefa dos pesquisadores era mais simples. Eles precisavam ter certeza de que o plasmídeo com nucleotídeos sintéticos se multiplicaria com sucesso e seria passado para os organismos filhos.
Plasmídeos usados para transformar Escherichia coli
Imagem: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Nature / Departamento de Química / The Scripps Research Institute
Este plasmídeo, designado pINF, foi introduzido em E. coli. Porém, para copiá-lo, é necessário que muitos nucleotídeos estejam presentes no interior da célula bacteriana. Para este propósito, outro plasmídeo, pCDF-1b, foi inserido em E. coli. Ele continha o gene da diatomácea Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, que codifica a proteína NTT, que transporta nucleotídeos do meio nutriente para a célula.
No entanto, os cientistas enfrentaram várias dificuldades. Primeiro, as proteínas de Phaeodactylum tricornutum têm um efeito tóxico na célula de E. coli. Tudo por causa da presença neles de um fragmento da sequência de aminoácidos, que carrega uma função de sinalização. Graças a ela, a proteína assume a posição correta na célula da alga, após o que a sequência é retirada. A E. coli não conseguiu remover esse fragmento, então os pesquisadores a ajudaram. Eles foram capazes de remover os primeiros 65 aminoácidos do NTT. Isso reduziu significativamente a toxicidade, embora também tenha reduzido a taxa de transporte de nucleotídeos.
Outro problema era que os nucleotídeos sintéticos ficavam retidos nos plasmídeos por muito tempo e não eram substituídos quando o DNA era copiado. Como se viu, sua segurança dependia dos nucleotídeos que os cercavam. Para descobrir, os cientistas analisaram várias combinações incorporadas em 16 plasmídeos. Para entender se um nucleotídeo sintético havia saído da sequência, os pesquisadores usaram a tecnologia CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Imagem: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 é um mecanismo molecular que existe dentro das bactérias e permite que elas lutem contra bacteriófagos. Em outras palavras, essa tecnologia representa imunidade contra infecções virais. CRISPR é um pedaço especial de DNA. Eles contêm pequenos fragmentos de vírus de DNA que já infectaram os ancestrais das bactérias de hoje, mas foram derrotados por suas defesas internas.
Quando o bacteriófago entra na bactéria, esses fragmentos são usados como um modelo para a síntese de moléculas chamadas crRNA. Muitas cadeias de RNA diferentes são formadas, elas se ligam à proteína Cas9, cuja tarefa é cortar o DNA do vírus. Ele pode fazer isso somente depois que o crRNA encontra um fragmento complementar do DNA viral.
Se, em vez de crRNA, uma sequência de RNA complementar a um fragmento particular do plasmídeo for usada, Cas9 irá cortar o plasmídeo também. Mas, se houver nucleotídeos sintéticos nesse fragmento, a proteína não funcionará. Assim, usando CRISPR, é possível isolar aqueles plasmídeos que são resistentes a mutações indesejadas. Descobriu-se que em 13 de 16 plasmídeos, a perda de nucleotídeos sintéticos era insignificante.
Assim, os pesquisadores conseguiram criar um organismo com alterações fundamentais no DNA, capaz de retê-las em si indefinidamente.
Embora uma forma de vida semissintética tenha apenas dois nucleotídeos não naturais em seu genoma, que não são encontrados nos códons e não estão envolvidos na codificação de aminoácidos, é o primeiro organismo resistente cujo alfabeto do DNA consiste em seis letras. No futuro, os cientistas provavelmente serão capazes de usar essa inovação para sintetizar proteínas, criando assim um código genético artificial completo.
Alexander Enikeev
