A invenção do editor de genes CRISPR-Cas é chamada de revolução na biologia. Os cientistas prometem usá-lo para melhorar variedades de plantas e raças de animais para a agricultura, para tratar doenças genéticas congênitas em humanos. O correspondente da RIA Novosti foi ver quem e como o genoma está sendo editado.
O Centro de Edição de Genoma da Universidade Estadual de Moscou foi inaugurado há pouco mais de um ano - no campus. Sou recebido por seu diretor, Doutor em Química Peter Sergiev, e enquanto estamos no elevador ele se dedica um pouco à história da engenharia genética.
“O genoma já foi editado antes. Mas era difícil criar ferramentas para isso, demorava muito e muitas vezes o resultado não era o que queríamos”, afirma.
No biotério, Pyotr Vladimirovich muda para uma roupa azul de laboratório, eles me dão um macacão branco descartável e me pedem para limpar a câmera com álcool. Agora Petr Vladimirovich parece um cirurgião, e eu - como um assistente de laboratório da série "CSI - Crime Scene".
No laboratório estéril, um recipiente com óvulos fertilizados de camundongo e um tubo de ensaio com solução de RNA foram preparados para nós. Isso é tudo que você precisa para editar o genoma CRISPR-Cas.
CRISPR é um acrônimo em inglês para uma frase que literalmente significa "repetições palindrômicas curtas regularmente agrupadas". Na verdade, essas são apenas pequenas seções do DNA de vírus bacteriófagos embutidos no genoma bacteriano. Essas sequências são necessárias para o sistema imunológico bacteriano funcionar e servir como uma espécie de anúncio de "procurado pela polícia". Se a bactéria sobrevive após ser infectada com um bacteriófago, ela usa as enzimas da proteína Cas para cortar um pedaço de seu DNA e inseri-lo em seu genoma para ser reconhecido posteriormente. O genoma bacteriano herda essa biblioteca de "inimigos" cuidadosamente coletada pelas gerações anteriores.
Em 2013, cientistas descobriram que a proteína Cas funciona em qualquer organismo, incluindo mamíferos. Ele é capaz de fazer quebras direcionais em ambas as fitas da molécula de DNA e, assim, alterar o genoma.
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Manipulação de ovo
Petr Sergiev faz um capilar de vidro com um diâmetro de cem mícrons na micro forja, puxa o ovo para dentro dele e o transfere sob o vidro com um meio nutriente. A amostra finalizada é enviada para o estágio do microscópio óptico. O monitor exibe uma imagem ampliada do ovo, estremecendo na ponta do capilar. Dois pontos arredondados se destacam - são pró-núcleos com o DNA da mãe e do pai.
O cientista prepara outro capilar com uma ordem de magnitude menor em diâmetro. Esta é uma seringa de injeção. Ele coleta uma solução com dois tipos de RNA e, com a ajuda de manipuladores, perfura suavemente o ovo. É isso, a injeção está feita.
O RNA injetado no ovo é necessário para cortar o genoma em um determinado local. Um tipo de RNA contém uma sequência estritamente definida de nucleotídeos, semelhante àquela que pretendíamos alterar. A tarefa desse RNA é encontrar a região correspondente no DNA, por isso é chamado de "guia". O RNA do segundo tipo, matriz, é um tipo de instrução para a síntese da proteína nuclease Cas9. Essa proteína atua como um catalisador para uma reação química que quebra as ligações fosfodiéster entre bases de DNA bem definidas. Como a molécula da proteína possui dois centros de nuclease, ambas as fitas de DNA se abrem, aliás, no local, cujas coordenadas Cas9 "contava" com o RNA guia.
A molécula de DNA percebe a quebra em ambas as fitas como uma falha grave e procura repará-la. As enzimas exonuclease que flutuam na célula removem imediatamente vários nucleotídeos de ambas as extremidades do intervalo. Isso é o suficiente para quebrar ou, como dizem os geneticistas, “desligar” um gene.
Como funciona o editor genômico CRISPR-Cas9 / Ilustração de RIA Novosti. Alina Polyanina.
Se uma mutação direcionada é necessária, por exemplo, é necessário marcar uma proteína para rastreá-la no corpo, então outro modelo é adicionado ao complexo para dois RNAs na forma de um DNA especialmente projetado. Consiste em sequências idênticas às arestas da quebra futura e também contém a seção a ser inserida. Depois que Cas9 cortou a molécula de DNA, suas extremidades são conectadas usando este modelo adicional, de modo que o conjunto de nucleotídeos de que precisamos é inserido na quebra.
“Podemos prender uma pequena cauda ao esquilo, pela qual é conveniente puxá-lo para fora e ver com o que ele interage. Podemos inserir um gene, mas não é tão eficaz quanto desligá-lo”, continua o cientista.
OGM e quimeras
O óvulo editado será transplantado para a tuba uterina de um camundongo substituto. Ela viveu por algum tempo com um homem cujos túbulos seminíferos foram amarrados. O casal tinha uma vida sexual normal, mas não conseguia engravidar. Mesmo assim, o corpo do rato acreditou que ela estava grávida e formou a base hormonal apropriada para ela. Agora esta fêmea está dando à luz o feto de outra pessoa.
Em três semanas, ela dará à luz os ratos mais comuns. Os cientistas vão esperar até que os roedores cresçam, pegar um pequeno pedaço de sua cauda e usar PCR para analisar o pedaço de DNA que eles editaram. Uma mutação ou um gene desativado é encontrado em mais da metade dos casos. O procedimento inverso - inserção de uma sequência no genoma - tem sucesso em não mais que 10% dos experimentos.
Vários efeitos interessantes aparecem durante a edição. Por exemplo, nascem camundongos mosaico, ou quimeras, que possuem células com diferentes variações dos genomas materno e paterno. Cas9 pode cortar o DNA muitas vezes, mas o RNA mensageiro que o codifica não é eterno e a solução injetada simplesmente desaparece em uma série de divisões celulares. Às vezes, o editor ainda dispara novamente depois que os pronúcleos se fundem e o ovo é compartilhado. E como o reparo do DNA após uma ruptura é sempre um processo aleatório e a cura nunca acontece da mesma maneira, algumas células de um organismo conterão outra mutação.
Para ciência e medicina
Passamos para a sala adjacente para assistir aos resultados ao vivo dos experimentos de edição do genoma. Nas prateleiras à esquerda - recipientes com camundongos geneticamente modificados, à direita - com roedores comuns para controle. Eles cresceram, como os da esquerda, mas o genoma não foi manipulado. Os ratos de controle são necessários para ter uma norma diante de nossos olhos e comparar com ela as criaturas obtidas no experimento.
Pyotr Sergiev pega um dos contêineres com um par de ratos cinza. Externamente, eles são completamente comuns, mas não têm descendência. O fato é que no homem o gene de uma das RNA metiltransferases, uma enzima produzida apenas nos espermatozoides, está desligado. Os machos com um gene inativo nascem estéreis. A finalidade exata do gene e da enzima ainda é desconhecida. Para descobrir, duas linhagens de camundongos foram criadas em laboratório: uma tinha um gene desativado, a outra tinha uma proteína marcada com um editor genômico.
“Uma mutação neste gene também é encontrada em humanos - então o homem sofre de infertilidade. Mas até descobrirmos por que ele é necessário, por que ele modifica o RNA, não seremos capazes de ajudar esses pacientes”, argumenta o cientista.
Na verdade, ainda não sabemos a função da maioria dos genes humanos. Descobrir isso é uma tarefa fundamental resolvida por muitos grupos de pesquisa em todo o mundo, inclusive na Rússia. O genoma do camundongo é muito semelhante ao dos humanos. Espera-se que, com a ajuda do CRISPR-Cas, o estudo do genoma de qualquer criatura seja mais rápido.
O grupo de Sergiev junto com N. N. NN Petrova começou a procurar mutações que levassem a alguns tipos de câncer. Os planos mais próximos incluem um projeto para criar animais geneticamente modificados para a agricultura em cooperação com o Instituto de Pesquisa de Criação Animal de Toda a Rússia e o Instituto de Biologia Genética da Academia Russa de Ciências.
“CRISPR-Cas é uma ferramenta fantástica que permite alterar o genoma a seu critério, para ser um pouco de Deus. Em última análise, a tarefa da ciência é entender como funciona uma criatura tão complexa como o mamífero”, diz o cientista.
Resolver problemas fundamentais da ciência é ótimo, mas o que essa tecnologia dará à medicina? Num futuro próximo, infelizmente, não muito. É fácil editar um ovo e criar um camundongo geneticamente modificado, mas é impossível corrigir os genes de um animal adulto, muito menos de um humano.
Métodos para editar DNA em células somáticas (ou seja, células já formadas) ainda são muito ineficazes. Para introduzir em uma célula algum gene desativado por mutação e forçá-lo a produzir uma determinada proteína, você precisa remover algumas das células do corpo, editar o DNA nelas e colocá-lo de volta no corpo. Em princípio, espera-se que assim seja possível combater doenças como a distrofia muscular de Duchenne ou a fibrose cística, quando é necessário restaurar a capacidade de trabalho de alguma parte das células. Quanto à predisposição ao câncer, até agora o editor genômico está impotente. Se um gene mutante for encontrado em uma pessoa, ele será encontrado em todas as células do corpo. Não é realista mudar todos eles. E cada célula com uma mutação é uma fonte de perigo.
Mas mesmo que o CRISPR / Cas possa ajudar a responder apenas a algumas questões fundamentais e permitir o tratamento de doenças genéticas raras, ainda assim será um grande passo para a humanidade.
Tatiana Pichugina
