A EGenesis, especializada na produção de porcos geneticamente modificados para transplante de órgãos humanos, anunciou o nascimento de vários animais editados. Eles perderam três genes, adquiriram nove e também perderam 25 vírus que se multiplicaram no genoma. Ao mesmo tempo, os porcos são completamente saudáveis e férteis, e suas células não agridem os componentes do sistema imunológico humano. Os ensaios clínicos de transplantes em humanos estão planejados nos próximos anos. Uma pré-impressão do trabalho está postada no portal bioRxiv.
Existem três obstáculos para o transplante de órgãos humanos. A primeira é a compatibilidade fisiológica: o órgão deve ser adequado em tamanho, estrutura e função. Nesse sentido, um objeto conveniente é um porco, muitos de cujos órgãos - por exemplo, o coração ou os rins - não diferem significativamente dos humanos.
O segundo obstáculo é a rejeição imunológica. O corpo humano reage com cautela a qualquer molécula desconhecida, mas algumas - por exemplo, açúcares na superfície de células estranhas - causam uma agressão especialmente forte.
Finalmente, o terceiro são os vírus que cada organismo carrega em seu genoma. Não estamos falando de vírus ativos que causam epidemias, mas de vírus endógenos, ou seja, aqueles que não matam a célula, mas se multiplicam apenas dentro de seu núcleo. Mas se a célula ainda mantém seus próprios vírus sob controle, então, se células estranhas a infectarem com novos vírus, então ela pode não ser capaz de lidar com as consequências de sua reprodução.
Para que o órgão de um porco se torne compatível com os humanos, levando em consideração todos esses requisitos, é necessário fazer alterações imediatas em vários genes. No início, eles tentaram fazer isso por meio de nocautes genéticos, e o coração de um porco com vários nocautes permaneceu no corpo do babuíno por três anos inteiros.
Mas em 2015, o geneticista americano George Church e o biólogo chinês Luhan Yang fundaram a eGenesis, uma empresa cujo objetivo era criar porcos modificados por vários genes ao mesmo tempo. Depois de um tempo, os cientistas liderados por Church relataram que foram capazes de limpar completamente as células de porco de retrovírus endógenos. Agora Church e Jan deram o próximo passo: criar animais "livres de vírus" e imunologicamente compatíveis.
Para fazer isso, os pesquisadores da eGenesis tiveram que desenvolver um protocolo de várias etapas. Para começar, eles colheram uma cultura de fibroblastos da orelha de um porco comum. Com a ajuda da eletroporação, moléculas do sistema CRISPR / Cas9 foram introduzidas neles para cortar três genes do DNA que causam a rejeição mais forte do corpo humano. Ao mesmo tempo, um plasmídeo com nove novos genes já humanos foi introduzido nas células, responsáveis por suprimir a resposta imunológica e os processos de coagulação do sangue. Assim, as células resultantes não devem apenas não causar agressão imunológica, mas também suprimi-la.
Depois de confirmar que a edição foi bem-sucedida, os cientistas removeram os núcleos de fibroblastos e os colocaram em óvulos sem núcleo - um método de clonagem estabelecido há muito tempo. Os embriões se desenvolveram a partir dos ovos, que foram plantados em mães de aluguel, que deram à luz leitões da primeira geração. Esses porcos ainda carregavam vírus, mas já deveriam ser imunologicamente compatíveis com humanos.
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Os cientistas isolaram novamente uma cultura de fibroblastos de seu corpo e realizaram o próximo estágio de edição nela: novamente, usando eletroporação, o sistema CRISPR / Cas9 foi introduzido nas células, que atacou o gene da transcriptase reversa, uma enzima chave com a qual os vírus endógenos se reproduzem no genoma. Em seguida, os núcleos das células também foram isolados, colocados no interior dos oócitos, e os leitões de segunda geração foram obtidos. Os porcos, portanto, perderam três genes, ganharam nove e também perderam vinte e cinco vírus de multiplicação ativa.
Os pesquisadores verificaram que os porcos editados eram geneticamente estáveis. Em suas células, oito entre nove genes humanos foram realmente expressos e os genes que causam rejeição imunológica foram "silenciosos". Os cientistas verificaram o genoma animal em busca de traços de edição fora do alvo e encontraram várias "falhas" CRISPR / Cas9, mas elas não afetaram as regiões codificadoras de proteínas do DNA.
Os próprios animais eram fisiologicamente saudáveis e férteis. Apesar de interferir com sua imunidade e sistema de coagulação do sangue, suas contagens sanguíneas estavam dentro dos limites normais. Os cientistas também não encontraram nenhum efeito da edição no trabalho do coração, fígado e rins dos porcos.
Finalmente, os pesquisadores testaram se os porcos modificados geneticamente adquiriram as propriedades necessárias para o transplante. Primeiro, eles isolaram uma cultura de células das paredes dos vasos de porcos e a trataram com imunoglobulinas humanas: elas se ligam a células modificadas 90% menos do que as normais. Então, essas células foram influenciadas pelas proteínas do complemento humano - elas reagem à presença de células estranhas ainda mais cedo do que as imunoglobulinas - mas o sistema do complemento não foi ativado com mais freqüência do que no caso de suas próprias células humanas.
Assim, os cientistas conseguiram criar animais cujas células não causam agressão imediata da imunidade humana. Apesar de o sistema imunológico poder reagir a células estranhas posteriormente, reconhecendo nelas proteínas mais raras, isso pode ser resolvido com a ajuda de imunossupressores. A edição, por outro lado, permite evitar a rejeição aguda e ganhar tempo para o órgão se enraizar dentro do corpo. Em uma entrevista à Science, Yang esclareceu que a empresa planeja se concentrar em testes pré-clínicos em 2020, mas espera passar para a pesquisa em humanos nos próximos cinco anos.
Autor: Polina Loseva
