A engenharia genética abre oportunidades para a humanidade criar organismos até então inexistentes e destruir doenças genéticas. No entanto, as coisas não estão tão animadas, já que mesmo a tecnologia inovadora CRISPR / Cas9 está longe de ser perfeita. Os erros que ela comete podem ser raros, mas um é o suficiente para se tornar fatal para uma pessoa. Lenta.ru fala sobre o que há de errado com o CRISPR e como os cientistas estão tentando consertar a situação.
O sistema CRISPR / Cas9 - uma espécie de tesoura de DNA - é legitimamente considerado uma revolução no campo da engenharia genética. Com sua ajuda, os cientistas podem editar o genoma humano, removendo mutações prejudiciais e, assim, tratar doenças hereditárias desagradáveis e mortais. Não se deve pensar, entretanto, que não existiam tais métodos antes. No arsenal dos geneticistas estavam, por exemplo, nucleases contendo "dedos" de zinco, e endonucleases - enzimas que quebram moléculas de DNA em locais específicos. Em termos de precisão, versatilidade e custo, são visivelmente inferiores ao CRISPR / Cas9, embora este último esteja longe de ser perfeito.
CRISPR / Cas9 foi originalmente criado não por cientistas, mas pela natureza. É um mecanismo molecular que existe dentro das bactérias e permite que elas lutem contra bacteriófagos e outros parasitas. Na verdade, funciona como uma imunidade contra infecções. CRISPR (significa "repetições palindrômicas curtas, regularmente espaçadas em grupos") são regiões especiais (loci) de DNA. Eles contêm pequenos fragmentos de vírus de DNA que já infectaram os ancestrais das bactérias de hoje, mas foram derrotados por suas defesas internas. Essas peças são chamadas de espaçadores e são separadas umas das outras por sequências repetidas.
Quando um bacteriófago invade uma bactéria, cada sequência repetida e espaçador adjacente são usados como um modelo para a síntese de moléculas chamadas crRNAs. Muitas cadeias de RNA diferentes são formadas, elas se ligam à proteína Cas9, cuja tarefa é extremamente simples: cortar o DNA do vírus. No entanto, ele será capaz de fazer isso somente depois que o crRNA encontrar um fragmento complementar do DNA viral. Depois que Cas9 separa o ácido nucleico estranho, o último é completamente destruído por outras nucleases.
O CRISPR / Cas9 é bom justamente por sua acurácia, pois para as bactérias o funcionamento correto do sistema imunológico é uma questão de vida ou morte. O sistema "antivírus" precisa encontrar uma seção do DNA viral entre um milhão de outras e, o mais importante, não confundi-la com seu próprio genoma. Ao longo de milhões de anos de evolução, as bactérias aperfeiçoaram esse mecanismo. Então, logo depois de descobrir por que um sistema CRISPR era necessário, eles perceberam que ele poderia ser domesticado como uma ferramenta de edição de genes sem precedentes.
Para substituir uma região específica do genoma por outra, é necessário sintetizar o RNA guia, que é em princípio semelhante ao crRNA. Ele diz ao Cas9 onde é necessário fazer uma quebra de fita dupla no DNA do organismo modificado. No entanto, não precisamos estragar o gene, mas modificá-lo - por exemplo, substituir um ou mais nucleotídeos e remover a mutação prejudicial. Aqui a natureza vem ao resgate novamente. Mecanismos de reparo natural imediatamente começam a restaurar a corrente cortada. O truque é que, para isso, alguns fragmentos de RNA são removidos perto da quebra, após o que sequências semelhantes são inseridas lá. Os cientistas podem substituí-los por suas próprias sequências de DNA e, assim, modificar o genoma.
Representação esquemática de CRISPR
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Imagem: Kaidor / Wikipedia
Porém, nada é perfeito. Apesar de sua relativa precisão, o CRISPR às vezes comete erros. Uma das razões reside na própria natureza do sistema. É desvantajoso para as bactérias que o crRNA coincida em 100 por cento com um fragmento de DNA viral, que pode diferir em um ou dois nucleotídeos. É melhor para ela que alguns nucleotídeos possam ser diferentes, o que dá ao microrganismo uma chance melhor de combater a infecção. Ao mesmo tempo, na engenharia genética, a baixa especificidade ameaça os erros: as mudanças podem ser feitas no lugar errado. Se isso acontecer durante os experimentos com ratos, não haverá nenhuma tragédia especial, mas a edição do genoma humano pode se transformar em um desastre.
Isso explica a preocupação dos cientistas ocidentais com os experimentos que estão sendo realizados na China. Pesquisadores asiáticos usaram a tecnologia CRISPR para modificar geneticamente embriões humanos. Esses experimentos foram proibidos na Europa e nos Estados Unidos, mas recentemente o Reino Unido os permitiu - apenas para fins de pesquisa. Esses embriões terão de ser destruídos algumas semanas após o recebimento, o que exclui a "reprodução" de pessoas GM.
No entanto, CRISPR / Cas9 não seria tão bom se não pudesse ser melhorado. Então, os cientistas ensinaram Cas9 a cortar não duas cadeias de uma vez, mas apenas uma. O corte é feito em dois locais diferentes na sequência de DNA em fitas diferentes, então o sistema deve ser capaz de reconhecer o dobro de nucleotídeos do normal, tornando-o mais preciso.
Proteína Cas e crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Cientistas da University of Western Ontario descobriram outra maneira de aprimorar essa tecnologia. Eles tentaram resolver o problema de reparar o DNA cortado. A rápida restauração da cadeia de ácido nucléico leva ao fato de que os cientistas não têm tempo para fazer suas próprias correções no genoma. Assim, cria-se um círculo vicioso: a cadeia, reparada de forma indesejável, tem que ser cortada novamente com a proteína Cas9.
Para evitar que isso aconteça, os pesquisadores modificaram a tesoura de proteína para criar a proteína TevCas9. Ele corta a fita de DNA em dois lugares, dificultando o reparo do local. Para sintetizar a nova enzima, a enzima I-Tevl foi adicionada à Cas 9, que também é uma endonuclease, ou seja, uma proteína que cliva uma molécula de DNA no meio, em vez de separar as extremidades da sequência, como fazem as exonucleases. A proteína de fusão resultante revelou-se mais precisa na ligação a locais específicos e menos propensa a cometer um erro e cortar o local errado.
Estrutura cristalina de Cas9 ligada ao DNA
Foto: Projeto wiki Cas9 / Wikipedia
Existe outra maneira de melhorar a precisão dos sistemas CRISPR. A "corrida armamentista" entre bactérias e vírus levou não apenas ao desenvolvimento de sistemas de defesa em microrganismos, mas também a formas de neutralizá-los. Assim, os bacteriófagos sofrem mutações rapidamente, perdendo as áreas pelas quais a imunidade bacteriana os reconhece. No entanto, alguns codificam para proteínas anti-CRISPR, interferindo no trabalho do complexo crRNA-Cas9.
Em 8 de dezembro, a revista Cell publicou um artigo de cientistas da Universidade de Toronto que criaram o "anti-CRISPR" - um sistema que permite desligar o mecanismo sob certas condições. Ele evita erros indesejados, suprimindo a atividade Cas9 no caso de o RNA guia se ligar ao fragmento errado. O anti-CRISPR consiste em três proteínas que inibem a nuclease e são codificadas pelos genes de um dos vírus bacterianos.
A tecnologia CRISPR já está sendo usada para tratar doenças graves, como leucemia e câncer de pulmão, e também está sendo testada para limpar o HIV das células do sistema imunológico. Conforme os cientistas encontram novas maneiras de melhorar este método, mais e mais possibilidades para sua aplicação se abrirão.
Alexander Enikeev
