Amostras de tecidos de múmias sob os nomes "Maria" e "Vavita" foram enviadas do Peru a um laboratório russo para pesquisas. As amostras de tecidos biológicos fornecidas foram estudadas por meio de microscopia eletrônica de varredura, espectros Raman, ICPE, e investigada a composição da terra de diatomáceas (uma substância na superfície da pele das múmias). Também foi realizado um estudo do DNA dos tecidos transferidos.
Preparação de amostra
Amostras de tecido, 500 μg cada, foram transferidas para tubos de plástico e dissolvidas em 1 ml de tampão (Tris-HCl 10 mM pH = 10,5, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 M). Às suspensões resultantes, foi adicionado dodecil sulfato de Na a 0,5%, aquecido a +80 C e, após 10 minutos, a proteinase K (até 500 μg / ml) foi colocada em um termostato (+55 C) por 24 horas.
A desproteinização foi realizada pelo método fenólico: adição de fenol em volume igual à suspensão, em seguida fenol: clorofórmio (1: 1), clorofórmio; após cada adição, foi realizada agitação constante em rotor angular e centrifugação a 15 mil rpm, 10 min.
Ao super-sedimento obtido após a 3ª centrifugação foi adicionado 1/10 parte do volume de NaCl 1 M e 2,5 volumes de álcool etílico duas vezes destilado, e deixado durante a noite a -30 C em tubos de ensaio cônicos - "Eppendorf". A centrifugação foi realizada a 15 mil vol. min. em 10 minutos e recebeu DNA "precipitado" na forma de um precipitado marrom. O sedimento de DNA foi lavado duas vezes com álcool etílico a 70% e seco à temperatura ambiente (1 h) e depois dissolvido em tampão TE.
O PCR foi realizado em um termociclador programável "My Cycler" ("Bio = Rad") usando oligoprímeros padrão sintetizados pelo método de fase sólida na associação "Beagler" (St. Petersburg). A mistura de reação para amplificação com um volume de 25 μL incluiu: 15 nM de cada oligoprímero, Tris-HCI 67 mM pH = 8,8 a +25 C, (NH4) SO4 de 16,6 mM, MgCl2 6,7 mM, EDTA 6,7 μM, 2 mercaptoetanol 10 mM, 170 μg / ml de BSA e uma mistura de quatro dNTPs básicos a uma concentração de 1,0 mM cada e DNA polimerase termoestável Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Após desnaturação (10 min, 94 C), 35 ciclos de amplificação foram realizados para cada sistema de teste: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Para controlar a especificidade, amostras de DNA com genótipos conhecidos para os loci estudados (sistemas de marcadores), bem como amostras de controle, foram introduzidas na reação.contendo uma mistura de reagentes sem DNA. Após a amplificação, um tampão de coloração foi adicionado às alíquotas da mistura reacional (7 μl) e separado por eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 6% (210x150x1 mm), corado com brometo de etídio e fotografado sob luz ultravioleta. Para identificar os alelos, foram usados padrões alélicos correspondentes a esses loci ("ladders").
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Análise de DNA
Para o estudo, utilizamos o método de análise de exoma de DNA humano baseado em sequenciamento de alto rendimento com enriquecimento por hibridização.
Técnica de análise de exoma de DNA humano.
2 amostras foram analisadas … Todas as etapas do preparo da amostra antes da PCR foram realizadas em salas limpas. A preparação da amostra, extração de DNA e amplificação de fragmentos individuais de DNA foram realizadas em salas diferentes.
Adaptadores específicos (KAPA Library Preparation Kit e SeqCap Adapter Kit; Roche) foram ligados às extremidades do DNA fragmentado genômico (~ 5 ng), após o que uma seleção de fragmentos em dois estágios na faixa de comprimento de 200-350 bp foi realizada usando AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … Os fragmentos resultantes foram amplificados usando primers específicos para adaptadores e hibridizados com sondas específicas biotiniladas (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) por 28 h a 47 ° C. Em uma reação, duas amostras de DNA foram combinadas. Híbridos de sonda-DNA biotinilados foram isolados e purificados com partículas magnéticas conjugadas com estreptovidina; uma segunda amplificação e avaliação qualitativa da biblioteca de DNA resultante foi realizada (TapeStation 4200; Agilent Technologies). A fim de remover fragmentos de amplificação fora do alvo e dímeros adaptadores, a biblioteca de DNA foi re-purificada usando partículas magnéticas AMPureXP Beads (Fig. 1). A concentração final da biblioteca preparada foi avaliada em um instrumento Quantus usando um kit comercial QuantiFluor® dsDNA System (Promega). A biblioteca de DNA resultante foi imobilizada na superfície da célula de fluxo. O sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina usando um Standard Flow Cell e o MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciclos). A biblioteca de DNA resultante foi imobilizada na superfície da célula de fluxo. O sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina usando um Standard Flow Cell e o MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciclos). A biblioteca de DNA resultante foi imobilizada na superfície da célula de fluxo. O sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina usando um Standard Flow Cell e o MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciclos).
Figura: 1
Avaliação geral da qualidade do DNA sequenciado
Métodos padrão como FastQC e os programas Jellyfish e KraTER foram usados para a avaliação de qualidade inicial. A avaliação de qualidade não mostrou problemas de qualidade com as leituras de DNA sequenciadas para ambas as amostras. As imagens não são mostradas porque não são informativas.
Para a primeira amostra (mais M, múmia grande "Maria"), 113,4 M de leituras foram sequenciadas, para a segunda amostra (mais W, múmia pequena "WaWita") 22,9 M de leituras foram sequenciadas.
A próxima etapa era limpar as leituras sequenciadas de várias sequências técnicas que interfeririam em análises posteriores. Para isso, foi utilizado o programa Cookiecutter. Após a limpeza, havia 113,3 M (99%) leituras e 22,8 M (99%) leituras, respectivamente, para M e W.
Estimativa da quantidade de DNA antigo e sua separação do moderno
O método padrão para avaliar a presença e a quantidade de DNA antigo é estimar a quantidade de nucleotídeos danificados pelo tempo. Para isso, foi utilizado o programa MapDamage 2.0. MapDamage 2.0 que mostrou a quantidade de DNA antigo em 30,1%, mas como MapDamage implica que estamos usando uma referência próxima e não sabemos exatamente quão próximas ambas as amostras estão do genoma de humanos modernos, e usamos uma biblioteca de exoma, este método em si não era suficiente. Outro bom método para avaliar o DNA antigo é o número de fragmentos curtos.
A filtração do suposto DNA antigo ocorreu em três estágios. No primeiro estágio, removemos todas as leituras emparelhadas que não podem ser cruzadas e reunidas em uma leitura desemparelhada com uma sobreposição. Essas leituras indicaram que o fragmento original sequenciado tinha mais de 300 bp. e provavelmente o DNA moderno. Após essa etapa, permaneceram 86,9% e 91,8%, respectivamente. Depois disso, fragmentos únicos sobrepostos foram selecionados de forma que seu comprimento fosse menor que 150 bp, já que esse é o comprimento que esperávamos para o DNA antigo. Após esta etapa, permaneceram 8,6% e 38,5%, respectivamente, para as amostras M e W. Note-se que apesar da diferença em porcentagem, o número absoluto de leituras entre as amostras M e W é muito semelhante: 9,8M e 8,8M, o que pode ser explicado pelo fato de o conteúdo do DNA antigo em ambas as amostras é semelhante.
| Parâmetro | Amostra M (Maria) | Amostra W (Wawita) |
| Número de leituras | 113,3 milhões | 22,8 milhões |
| Porcentagem de fragmentos curtos <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Porcentagem de fragmentos curtos <150 bp (número) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Porcentagem de fragmentos alinhados por genoma humano (número) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2.264.551) |
| Porcentagem de fragmentos alinhados por genoma humano de curto <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Obtenção de DNA semelhante ao genoma humano de referência
O suposto DNA antigo resultante foi mapeado para um genoma humano de referência usando um pipeline de pesquisa de variantes genômicas padrão usando BWA, samtools e Wcftools.
Além disso, apenas 23,8% da amostra M e 25,6% foram mapeados com sucesso para o genoma de referência de humanos modernos. Ao mesmo tempo, para ambas as amostras, 75% das leituras sequenciadas não puderam ser mapeadas no genoma humano. Isso pode ser explicado tanto pela contaminação quanto pelo fato de essas amostras estarem localizadas longe o suficiente do genoma dos humanos modernos. Ao mesmo tempo, é importante ter em mente que sequenciamos a biblioteca de exomas e, assim, minimizamos a contaminação do DNA bacteriano.
A análise inicial de reconhecimento de leituras não cozidas mostrou que algumas delas pertenciam a DNA repetitivo específico para ungulados, isso pode ser explicado pelo fato de que a gordura da lhama foi usada na mumificação.
Uma análise mais detalhada requer cerca de três semanas de cálculos, já que as soluções existentes são feitas apenas para genomas virais e bacterianos, e precisamos comparar com todos os genomas existentes, inclusive genomas de plantas, para entender quais espécies foram sequenciadas.
Características das opções encontradas
As leituras mapeadas foram usadas para pesquisar variantes que distinguem as amostras M e W do genoma humano moderno, bem como para avaliar a contaminação das leituras do cromossomo Y humano.
A primeira pergunta que precisava ser respondida era para quais cromossomos as leituras sequenciadas foram mapeadas.
Como sabemos que as amostras de Maria foram isoladas de ossos e músculos, e as de Vavita apenas de ossos, esperávamos uma diferença na quantidade de mtDNA. Mas não houve muita diferença.
O número de leituras mapeadas em Y é outro teste de contaminação por humanos modernos. Curiosamente, acabou sendo o mesmo em ambas as amostras.
As estatísticas para as variantes encontradas são mostradas abaixo:
| Parâmetros | Amostra M (Maria) | Amostra W (Wawita) |
| Número de opções encontradas | 79957 | 48941 |
| Número de opções em Y | 534 | 541 |
| O número de opções confiáveis (mais de 20 leituras e mais de 30 de qualidade) | 16969 | 6181 |
| Variantes com rsid conhecido (disponível no banco de dados snip) | 5701 | 3089 |
| Opções gerais válidas | 92 | |
| opções comuns com rsid | 49 |
Depois disso, foi possível responder à pergunta: M e W são parentes? A resposta é não.
Apenas 49 variantes correspondentes foram encontradas entre M e W e 3040 diferindo para variantes com rsid conhecido. Além disso, talvez sejam diferentes tipos ou subespécies de uma pessoa ou criatura desconhecida.
Curiosamente, as variantes com o cromossomo Y são idênticas para ambas as amostras, o que indica contaminação pela mesma pessoa, e que no DNA antigo do cromossomo Y provavelmente ainda não há cromossomo.
Avaliação da similaridade com os genomas humanos sequenciados existentes do Projeto Genoma Humano 1000
Observe que esta é apenas uma análise aproximada, uma vez que, para uma análise mais precisa, são necessárias variantes de regiões do genoma sob seleção neutra e temos dados de exoma.
No entanto, usando 5708 variantes para M ou 3096 para S, foi possível realizar uma variante da análise em comparação com os dados de 1000 genomas humanos.
O resultado da análise de PCA na imagem abaixo é uma sobreposição de duas imagens para M e W, calculadas separadamente, uma vez que existem muito poucas opções comuns entre M e W para estimar as distâncias entre M e W.
Pontuação de similaridade.
Como você pode ver, não há coincidência com nenhum grupo de genes, eles também diferem uns dos outros. Mas deve-se ter em mente que usamos sequências de codificação sob seleção, e é recomendado o uso de variantes sob seleção neutra.
No entanto, o resultado do PCA está de acordo com a verificação manual de variantes, que mostrou que os dados estão em um homozigoto não referenciado, o que novamente indica que as imagens estão longe do genoma humano moderno.
Conclusão
Infelizmente, ficamos limitados a apenas duas amostras, geralmente neste tipo de análise mais são usadas, pelo menos 3-10 pelo menos de alguma forma relacionadas. Portanto, é necessário continuar as pesquisas com um grande número de amostras.
Ao mesmo tempo, podemos muito provavelmente concluir que as amostras de DNA de Maria e Vavita correspondem ao DNA humano, mas não coincidem com o DNA disponível para nós em um banco de dados de 1000 pessoas.
Autores do relatório: Baranov V. S. e Aseev M. V. (Instituto de Pesquisa Científica de Obstetrícia e Ginecologia, Departamento de Diagnóstico Pré-natal), Glotov A. S. e Glotov O. S. (St. Petersburg State University), A. S. Komissarov (Instituto de Citologia, Academia Russa de Ciências, Centro de Bioinformática Genética).
Materiais fornecidos por Konstantin Georgievich Korotkov (Doutor em Ciências Técnicas, Professor, Universidade de Tecnologias da Informação, Mecânica e Óptica) e Dmitry Vladislavovich Galetsky (Candidato em Ciências Médicas, I. P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University).
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